細胞なしのDNAを使用して移植の後の固体器官の健康の監視

cfDNAに基づく診断はティッシュのバイオプシーを時代遅れにすることができます
多数の限定を持つために移植の後で同種移植片の拒絶を検出する高価で、侵略的なティッシュのバイオプシー。細胞なしのDNA （cfDNA）に基づく試金— DNAの循環の片は細胞、ティッシュから解放し、自然な細胞を経るように器官は死集中的に最近調査され、最終的に拒絶を検出する私達の機能を改善できます道具は管理で先に変わり、移植された器官の長期存続を高めます。
(WGS)を配列する全ゲノムのための必要性および供給および/または感受性がある遺伝子型のアプリオリな知識のための必要性を避けるCfDNAの試金に強力な記号論理学の利点があり、臨床精査の下に現在あります。さらに、提供者得られたcfDNA （ddcfDNA）の続く移植の器官特定の動力学の知識を改善することはまたこれらの試金を最大限に活用するのを助けました。実験室はまたデジタルしぶきのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および器官特定のDNAのメチル化パターンのようなddcfDNAの、量を示すための代替方式をもたらしました。そのように、cfDNAに基づいて最小限に侵略的な診断の分野はますます有望、可能性としては従来のティッシュのバイオプシーを取り替える1日です。
器官の拒絶に於いてのCFDNAの役割
受け手の免疫組織によって引き起こされる寄付された器官の傷害を示す拒絶により同種移植片の機能障害および忍耐強い死を引き起こすことができます。T細胞によって仲介される激しい細胞拒絶(ACR)は最も頻繁に後移植最初の6か月のの内に（1）起こります。ACRは同種移植片の間質性スペースで受け手の免疫組織が外国ように寄付された器官の抗原を確認すると同時にCD4+およびCD8+のT細胞の蓄積を含みます。これらのT細胞は標的細胞のプログラムされた細胞死（apoptosis）を最終的にもたらす免疫の滝を始めます。これらの細胞が死ぬと同時に、ゲノムDNAは裂かれ、血の感受性があるcfDNAのプールを結合するために長さがおよそ140の基礎組(bp)を測定するddcfDNAの片は解放され、尿（2）で最終的に排泄されます。
母性的な循環内の胎児DNAの片を分析し、癌関連の突然変異を識別するために腫瘍の細胞から解放される循環DNAを配列することを含む薬の他の区域の侵略的なバイオプシーを、取り替えるために遺伝的異常を子宮内で識別するために循環のcfDNAは最近ように診察道具てこ入れされてしまいました。の両方のこれらの場合では、また移植、DNA順序の相違を識別し、量を示す高効率の配列は明瞭な源から得られるcfDNAの2つの人口の間で（2）区別します。cfDNAの3つの特徴はそれに固体器官の移植の後で拒絶を検出するために優秀で非侵襲的な候補者のbiomarkerを作ります:それは簡単な血の引くこと、正確に測定される集中および容易に識別されるヌクレオチド順序から得ることができます。ACRのためのbiomarkerとしてcfDNAを使用して従って寄付された器官の傷つけられた細胞から得られ、同種移植片で行われる細胞死の直接測定を表すべきであるのでまた有利です。なお、cfDNAは元のゲノムDNAの遺伝特徴すべてを維持しま、自然なapoptosis （3）を経ている受け手の細胞から得られるcfDNAから区別されるべき寄付された器官から解放される遺伝物質を許可します。
同種移植片の健康の頻繁で、正確な監視は移植の受け手の長期存続のために必要です。中心の移植(HT)のために、endomyocardialバイオプシー（EMB）はACRを検出するための現在の金本位（4）です。但し、EMBsは多数がすべての器官に共通切り取って検査するの重要な限定と高価です、（5-7）。さらに、EMBsの侵略的な性質は複雑化（6,8,9）の危険がある状態にHTの患者を置きます。
残念ながら、エコー心電図検査またはイメージ投射(MRI)の磁気共鳴欠乏の十分な特定性を含む現在利用できる非侵襲的な確実に拒絶（10-13）を検出する方法および感受性。血ベースのbiomarkersは、cfDNAのような、臨床練習（14-17）に容易に実行できる有望な代わりを表します。
QUIESCENCEおよび拒絶の間のCFDNAの動力学
cfDNAがapoptosisの自然発生するプロセスから起きるので、すべての個人に血（18）でcfDNAの探索可能なレベルがあります。健康な個人のために、循環のcfDNAの大半は細胞転換と関連している自然死を経たhematopoietic細胞から来ます。cfDNAのレベルは伝染、外科、外傷、また更に徹底的な練習（2,19）を含んでいろいろな理由で変動します。従って、拒絶を検出するためにcfDNAベースの試金を開発することは受け手の循環の後移植にddcfDNA解放の期待された動力学の査定を要求します。この考察はddcfDNAそのうちに後移植の解放が器官特定であるので特に重要です（20-22）。
例えば、1人の日後HTにddcfDNAの平均レベルは3.8 ± 2.3% （20）です。但し、7日までにddcfDNAのレベルは急速に低下し、一貫して低く残ります（<1> 対照的に、最初のpostoperative日の26 ±の平均ddcfDNA一部分を14%持つと両側のある肺移植の受け手は見つけられました。なお、ddcfDNAの減少は最初の週の内に急速に低下したが、特徴付けられ、一方では遅れ、そして一般に残りましたddcfDNAのレベルによって1%-3% （21）に。但し、激しい拒絶のエピソードの間に中心および腎臓の移植に類似した、ddcfDNAのレベルは14%-15%の平均にかなり増加しま、上ります。
ddcfDNAのレベルのこの可変性のための細胞転換の記述のティッシュ固まりそして率の相違はquiescenceの間に早い後移植をおよび解放しました。例えば、静止両側のあるおよび単一肺移植のddcfDNAレベルの循環の相違は細胞転換の相違によってことができま、58個の細胞/対107二番目に説明するそれぞれ（21）です。対照によって、静止移植された中心で、細胞回転率は二番目にたった8個の細胞/です（21-23）。従って、ある特定の固体器官と関連付けられるddcfDNAの期待されたレベルの理解は拒絶を検出する器官特定の試金の開発を促進して必要です。特定器官のためのcfDNA解放の動力学が理解されれば、複数の方法はddcfDNAの相対的な量の量を示すためにあります。
受け手を対DONOR-DERIVED CFDNA区別する作戦
提供者受け手の性不適当な組み合わせ
提供者がオスであり、受け手がメスである移植のために、実験室は受け手の総cfDNAのプール（17）内のからのddcfDNAレベルを計算するためにこの性の不適当な組み合わせにてこ入れできます。研究者は最初にオスの提供者から腎臓を受け取ったときにとりわけY染色体（17）で見つけられた地域を含んでいた彼らの尿のddcfDNAの拒絶によって示された上昇値を経験したメスの腎臓の移植の受け手から取られた尿サンプルのこのアプローチの可能性を示し。このアプローチが同種移植片の拒絶の確信した診断を可能にするが、提供者と受け手間の性不適当な組み合わせは比較的まれ、例外なく適用できません。
提供者受け手DNA順序の相違
移植はまたゲノムの移植と移植された器官内の細胞が提供者の遺伝情報を含んでいるのでみなすことができます。そのように、ゲノムの移植の原動力(GTD)の概念は循環のcfDNA （20-24）の起源を識別するためにてこ入れすることができる特定の位置に提供者と受け手の遺伝の違いの存在に頼ります。理想的には、受け手は単一の基盤（例えば、AA）のためにhomozygousであり、同じ位置に提供者は別の基盤（例えば、GG）のためにhomozygousです。
個人間の遺伝の不均質を与えられて、ゲノムを渡る数万の可能性としては報知的な位置は配列する高効率を使用して感受性があるcfDNA （20,24）とddcfDNAを区別するために質問することができます。この概念は心臓提供者からの取引されたサンプルを使用して最初に各提供者受け手の組み合わせることのためのアプリオリな供給の遺伝子型を得るために説明されました。各受け手からのcfDNAを得、配列した後、提供者特定の分子の一部分は断固としたでした。バイオプシー証明された拒絶のでき事の間にまたはの前に取られたサンプルでは提供者特定の単一のヌクレオチドの多形(SNPs)の割合は3%-4% （24）から <1>増加すると見つけられました。
この早い回顧調査は今将来認可されました。大人および小児科の中心および肺移植の受け手は募集され、組が53,423の報知的なSNPのマーカーの平均のWGSを通して得られた各提供者受け手のための遺伝子型は（20）を識別しました。激しい拒絶の全体的にみて、早期発見はAlloMapの最初の食糧のそれより優秀で、ACRの検出にtranscriptomeの分析（25）に基づいてHTの後で管理公認の非侵襲的なアプローチに薬剤を入れます。
研究はまたWGSがだけでなく、接木また患者のviromeについての情報およびimmunosuppressionの全面的な状態を提供することを示しました。これは他の試金（26-28）によって得難い可能性としては大きい利点を表します。
但し、WGSはことができる挑戦に直面します臨床練習で定期的に実行されることを防ぐ。例えば、受け手の遺伝情報は容易に得ることができるがこれは提供者にあてはまません常に。さらに、WGSは高価、労働集約的、時間のかかります。
代替方式はそれにより提供者の特定の遺伝子型（29）のアプリオリな知識のための必要性を除去する得られたcfDNAのプールの内で識別されるgenotyped多形SNPsのパネルを用います。起こる腎臓およびレバー移植とは違って、中心のための提供者受け手の組はおよび肺移植は頻繁に密接に関連個人の間に普通関係していません。GTDは移植の受け手および提供者両方のgenotypingを要求します。但し、実際に、供給の遺伝子型情報は頻繁に利用できないです。ここでは、私達は供給の遺伝子型がない時ddcfDNAレベルを推定するアルゴリズムの開発によってこの問題を扱います。私達のアルゴリズムは慣習的なGTDに類似している正確さの中心および肺同種移植片の拒絶を予測します。私達はなお密接に関連受け手および提供者の骨髄および腎臓移植で共通であるシナリオを扱うためにアルゴリズムを精製しました。私達は隠されたマルコフ モデルを使用して無関係であるか、または提供者の兄弟である骨髄の移植患者のddcfDNAを推定することは可能であることを示します。従って、アルゴリズムは仮定する中心および肺移植のために提供者の遺伝子型は一般群衆として同じ周波数に起こると開発されました。受け手の知られていた遺伝子型にこれらの頻度および比較に基づいて、ddcfDNAの一部分は受け手の血しょうサンプルから隔離されるcfDNAの総プールから確実に推定することができます。
肺移植の場合には、この単一ゲノム モデルは、供給および感受性がある遺伝子型を使用して方法と比較されたときddcfDNAの対等な一部分を提供すると、見つけられました。但し、研究者がHTにこの同じアルゴリズムを適用したときに、ddcfDNAの推定レベルは肺移植で同様に強く関連しませんでした。これはHTの後で現在のddcfDNAのより低い絶対量と関連しているかもしれません。これは試金の結果に影響を及ぼすことができ、（30）考慮に入れられなければならない器官特定のcfDNAの動力学のもう一つの例です。
腎臓の移植の場合には拒絶のための実行可能なマーカーとして知られていた提供者特定のSNPsを使用して確認するために、前向き研究は識別されるddcfDNAレベルの実用性を行なわれました。1つのそのような調査では予定された間隔でそして臨床的に示されたバイオプシー（31）の時に血液サンプルを提供するために、384人の腎臓の受け手は14の臨床場所から募集されました。全体的にみて、調査は102人の患者からの107のバイオプシーの標本の組織学と一致させた血しょうサンプルで見つけられたddcfDNAのレベル間の相関関係に焦点を合わせました。すなわち、活動的な拒絶の27人の患者からの27のバイオプシーのサンプルは活動的な拒絶なしで75人の患者からの80のバイオプシーのサンプルと共に得られました。
この調査では、活動的な拒絶は激しい抗体仲介された拒絶(AMR)、慢性AMRおよびACRを含んでいました。この調査で使用された試金は活動的な拒絶の存在か不在を示すためにddcfDNAの一部分のための1%の締切りを用い、85%の特定性（95% CI、79%-91%）および59%の感受性（95% CI、44%-74%）があると見つけられました。この試金の感受性は83%の特定性（95% CI、78%-89%）および81%の感受性（95% CI、67%-100%）があると1% ddcfDNAの締切りの使用は見つけられたので、活動的な、不在AMRの間の区別のためにより大きかったです。特に、いずれの場合も、感受性はddcfDNAの一部分が3%を超過したときに大幅に低下しました。
拒絶を腎臓の移植に続くことを検出するように非侵襲的なcfDNAベースの試金の特定性そして感受性を改善するためには調査官はまたddcfDNA （32-33）の絶対量を調査しました。ddcfDNAの絶対量の質問によって、1つは非拒絶のでき事によって、伝染、可能性としてはより正確な試金を作成する外傷、または練習のような、引き起こされる総cfDNAのレベルの増加によるddcfDNAの一部分の人工的な変更を除去できます。
この可能性を調査するためには、1つの調査はある特定の位置（32）で供給および受け手SNPsの相対的な割合に対して人口頻度に、基づいて32の報知的な限定番号の変形(CNVs)を用いました。従って受け手のゲノムの内で現在のすべてのCNVsしかし得られたcfDNA内の現在はddcfDNAを表すと仮定されました。
興味深いことに特定性および感受性は絶対ddcfDNAレベルの使用と全面的に改良したが、この試金にまた活動的なACRの例に対して活動的なAMRの存在と不在の間で、区別するより大きい容量がありました。さらに、血清のクレアチニンのレベルは腎臓の組織の損傷（31-33）に対してglomerular機能をより表しているので本当らしい活動的な拒絶とquiescenceの間の区別で十分ではなかったです。
別の調査はtacrolimus、immunosuppressant （33）のレベルと関連していた腎臓の移植の受け手のddcfDNAの絶対レベルを探検しました。ここでは、研究者はddcfDNAの絶対量がより低いtacrolimusの患者で大幅により高かった水平になることが分りました（<8> 実験室はまたWGSに代わりを提案しました。124商用化されたパネルを使用して非常に多形（マイナーな対立遺伝子の頻度[MAF] >0.4） SNPsの私達のグループによって探検される目標とされた配列し、次世代の配列し、そして新しいアルゴリズム（34）。このアプローチはかなり要求された、減少した費用および試金の時間、および急速な分析を可能にすることの配列の総計を減らしました。但し、この試金は個人間のMAFの相違に頼るので、住関連の腎臓の寄付で見られるのような密接に関連提供者受け手の組のために強くないです。それは適当かより大きい拒絶のでき事を検出するために認可されることを残ります。
実験室はまた多形SNPsを使用してデジタルしぶきPCR （30,35-37）の技術と結合されるddcfDNAの量を示すために探検しました。41非常に多形SNPsを使用して、安定した腎臓およびHTの受け手は7% （35）のレベルを持っている安定したレバー移植の受け手との2%-3%のddcfDNA一部分を示しました。
結論
高価で、侵略的なティッシュのバイオプシーの使用に同種移植片の拒絶を検出する重要な限定があります。そのように、直接そして正確に全体の移植された器官の健康を査定できる最小限に侵略的な試金は固体器官の移植の聖杯を表します。
移植が最初の約束を示した後cfDNAの使用は、更に調査しが、cfDNAの基本的な生物学、また行動の後移植両方の私達の理解を改善するように確認は要求されます。現時点で、重要な器官特定の相違がある、cfDNA解放のパターンはまた拒絶のでき事のタイプによって異なるかもしれませんことは明確であり。但し、cfDNAは1つを最も有望な技術のけれどもティッシュのバイオプシーを補足するためにまた更に最終的に取り替えるために開発される表します。